Σχεδόν πριν από έναν αιώνα, μια σημαντική ανακάλυψη στη μικροσκοπία έδωσε στους επιστήμονες έναν εντελώς νέο τρόπο να εξετάζουν το εσωτερικό των κυττάρων. Η τεχνική, γνωστή ως μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, έκανε τις κυτταρικές δομές που προηγουμένως ήταν αμυδρές ή σχεδόν αόρατες πολύ πιο ευδιάκριτες. Η σημασία της αναγνωρίστηκε με την απονομή του βραβείου Νόμπελ το 1953.
Τώρα, φυσικοί από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στο Μπέρκλεϊ εφάρμοσαν την ίδια αρχή στην ηλεκτρονική μικροσκοπία, μια τεχνολογία ικανή να μεγεθύνει αντικείμενα περίπου 10.000 φορές περισσότερο από τα συμβατικά οπτικά μικροσκόπια.
Οι ερευνητές ανέπτυξαν μια συσκευή που ονομάζεται πλάκα φάσης λέιζερ, η οποία θα μπορούσε να βελτιώσει σημαντικά την κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία (cryo-EM). Αυτή η ισχυρή μέθοδος απεικόνισης έχει μεταμορφώσει τη μελέτη των πρωτεϊνικών δομών και έχει συμβάλει στην επιτάχυνση της ανακάλυψης φαρμάκων την τελευταία δεκαετία. Παρ' όλα αυτά, παρουσιάζει έναν σημαντικό περιορισμό: Οι περισσότερες ανθρώπινες πρωτεΐνες είναι τόσο μικρές, ώστε η λήψη καθαρών εικόνων τους εξακολουθεί να είναι εξαιρετικά δύσκολη.
Η νέα τεχνολογία λέιζερ θα μπορούσε να συμβάλει στην υπέρβαση αυτού του εμποδίου, επιτρέποντας ενδεχομένως στους επιστήμονες να απεικονίζουν πρωτεΐνες με μέγεθος μόλις το ένα τρίτο εκείνων που δυσκολεύουν τα σημερινά μικροσκόπια, σύμφωνα με το ScienceDaily.
Ακόμη μεγαλύτερος αντίκτυπος θα μπορούσε να προκύψει από τις βελτιώσεις στην κρυοηλεκτρονική τομογραφία (cryo-ET). Αυτή η νεότερη προσέγγιση συνδυάζει εικόνες που λαμβάνονται από πολλαπλές γωνίες, προκειμένου να δημιουργήσει τρισδιάστατες απεικονίσεις πρωτεϊνών και άλλων μορίων. Σε αντίθεση με τις τεχνικές που μελετούν μεμονωμένα μόρια μέσα σε ένα διάλυμα, η cryo-ET μπορεί να αποκαλύψει τον τρόπο με τον οποίο οι πρωτεΐνες είναι διατεταγμένες και αλληλεπιδρούν στο φυσικό κυτταρικό τους περιβάλλον.
«Η cryo-EM έχει γίνει η νέα, ταχύτερα αναπτυσσόμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό της δομής βιολογικών μακρομορίων, ενώ αναμένεται ότι η cryo-ET θα δείξει πώς αυτά τα μόρια συνεργάζονται στο φυσικό κυτταρικό τους περιβάλλον», δήλωσε ο Holger Müller, καθηγητής Φυσικής στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στο Μπέρκλεϊ και επιστημονικός ερευνητής στο Εθνικό Εργαστήριο Lawrence Berkeley, ο οποίος ηγήθηκε της προσπάθειας ανάπτυξης. «Ωστόσο, λόγω των περιορισμών που σχετίζονται με τον λόγο σήματος προς θόρυβο, η πλειονότητα των ανθρώπινων και ζωικών πρωτεϊνών είναι υπερβολικά μικρές για να αναλυθούν με αυτές τις μεθόδους. Η αύξηση του λόγου σήματος προς θόρυβο που παρέχει αυτή η πλάκα φάσης λέιζερ αναμένεται να ξεπεράσει αυτούς τους σημαντικούς περιορισμούς».
Ένα εξαιρετικά ισχυρό λέιζερ αποκαλύπτει κρυφές κυτταρικές δομές
Η ανακάλυψη βασίζεται σε αυτό που οι ερευνητές περιγράφουν ως το ισχυρότερο εστιασμένο λέιζερ συνεχούς κύματος στον κόσμο. Αντί απλώς να φωτίζει ένα δείγμα, το λέιζερ αλληλεπιδρά άμεσα με τη δέσμη ηλεκτρονίων του μικροσκοπίου, μεταβάλλοντας τη φάση της ώστε να αυξήσει την αντίθεση της εικόνας.
Αυτή η προσαρμογή διευκολύνει τη διάκριση μικρών μορίων, συμπεριλαμβανομένης της αιμοσφαιρίνης, από το περιβάλλον τους. Θα μπορούσε επίσης να βελτιώσει την ορατότητα δομών στο εσωτερικό των κυττάρων, όπως ο πυρήνας και τα μιτοχόνδρια.
«Με την cryo-ET, εξετάζουμε μικρό υλικό κυττάρων, πολύ περίπλοκο και απίστευτα πυκνό στο εσωτερικό του κυττάρου», δήλωσε η Bridget Carragher, ιδρυτική τεχνική διευθύντρια απεικόνισης στο Biohub, στο Ρέντγουντ Σίτι της Καλιφόρνιας. «Είναι σαν ένα δάσος γεμάτο δέντρα, μέσα στο οποίο προσπαθείς να βρεις ένα φύλλο σε ένα συγκεκριμένο δέντρο. Η cryo-ET χρειάζεται ένα δραστικό άλμα προς τα εμπρός στην αντίθεση, ώστε να αρχίσουμε να βλέπουμε τι συμβαίνει μέσα στο κύτταρο. Αυτό ακριβώς υπόσχεται να μας προσφέρει η πλάκα φάσης λέιζερ».
Με την οικονομική υποστήριξη του Biohub, ο Müller απέκτησε ένα προηγμένο όργανο cryo-EM και το εξόπλισε με τη νέα πλάκα φάσης λέιζερ. Ονόμασε το μικροσκόπιο Theia, από την αρχαία Ελληνίδα Τιτανίδα που συνδεόταν με το φως και τη λάμψη.
Παράλληλα, η Carragher διευθύνει την κατασκευή ενός συναφούς μικροσκοπίου στις εγκαταστάσεις απεικόνισης του Biohub στο Ρέντγουντ Σίτι. Το όργανο της ομάδας της χρησιμοποιεί δύο λέιζερ αντί για ένα, βασιζόμενο σε θεωρητική έρευνα που πραγματοποίησε ο Müller μαζί με τους συνεργάτες του.
Οι δύο δέσμες λέιζερ είναι διατεταγμένες κάθετα μεταξύ τους και καθεμία λειτουργεί περίπου στη μισή ισχύ. Αυτή η διάταξη συμβάλλει στην αποτροπή της υπερθέρμανσης και καταστροφής των εξαρτημάτων, ενώ παράλληλα μειώνει τις οπτικές παραμορφώσεις που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ποιότητα της εικόνας.
Και οι δύο ερευνητικές ομάδες συνεργάζονται με την Thermo Fisher Scientific, τον κορυφαίο κατασκευαστή οργάνων cryo-EM.
«Το Theia είναι το μικροσκόπιο της Formula 1», δήλωσε ο Müller. «Διαθέτει πρόσθετα ηλεκτρονικά οπτικά συστήματα που του προσφέρουν καλύτερη διακριτική ικανότητα από τη συμβατική cryo-EM, ακόμη και χωρίς το λέιζερ. Με την προσθήκη της πλάκας φάσης λέιζερ, ελπίζουμε ότι θα γίνει συνολικά το καλύτερο όργανο στον κόσμο».
Οι πιο πρόσφατες εικόνες και τα τεχνικά ευρήματα της ομάδας του Μπέρκλεϊ παρουσιάζονται στο περιοδικό Science. Λεπτομέρειες για τον σχεδιασμό του Biohub με τα δύο λέιζερ είναι διαθέσιμες σε μια πρόσφατα δημοσιευμένη προδημοσίευση επιστημονικής εργασίας.
Μια προσπάθεια 15 ετών για την αξιοποίηση ενός εξαιρετικά ισχυρού λέιζερ
Η μετατροπή της ιδέας της πλάκας φάσης λέιζερ σε λειτουργική τεχνολογία απαίτησε χρόνια μηχανολογικής ανάπτυξης.
Μετά την πρότασή τους το 2010, ο Müller αφιέρωσε 15 χρόνια στην υλοποίηση της ιδέας, με μέρος της έρευνας να χρηματοδοτείται από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των ΗΠΑ.
Η πρώτη σημαντική πρόκληση ήταν η παραγωγή μιας εξαιρετικά ισχυρής δέσμης λέιζερ, συγκεντρωμένης σε μια απειροελάχιστη περιοχή. Οι ερευνητές χρειάζονταν αρκετά υψηλή ένταση φωτός ώστε να μεταβάλουν τη φάση μιας δέσμης ηλεκτρονίων κατά 90 μοίρες. Χρειάστηκε μία δεκαετία για την ανάπτυξη του απαραίτητου συστήματος.
Στη συνέχεια, πρόσθετη χρηματοδότηση από το Biohub κατέστησε δυνατή την απόκτηση ενός προσαρμοσμένου, υπερσύγχρονου μικροσκοπίου cryo-EM Krios της Thermo Fisher και την τροποποίησή του, ώστε να μπορεί να φιλοξενήσει την τεχνολογία λέιζερ.
Στην πιο πρόσφατη έρευνά τους, οι επιστήμονες δοκίμασαν το αναβαθμισμένο μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας έξι διαφορετικά δείγματα, τα οποία διέφεραν ως προς το μέγεθος και τη μέθοδο προετοιμασίας τους. Το λέιζερ βελτίωσε σταθερά την ανάλυση των εικόνων, με ιδιαίτερα σημαντικές βελτιώσεις στα δείγματα που είναι δύσκολο να απεικονιστούν με τις συνήθεις μεθόδους.
«Στις πιο απαιτητικές περιπτώσεις —με μικρά σωματίδια και δείγματα κακής ποιότητας— το λέιζερ προσφέρει ένα πολύ σημαντικό πλεονέκτημα», δήλωσε ο Müller.
Ευκρινέστερες εικόνες πρωτεϊνών που προηγουμένως ήταν υπερβολικά μικρές για να μελετηθούν
Για να παρουσιάσουν τις δυνατότητες του νέου μικροσκοπίου, οι ερευνητές ανασύνθεσαν εικόνες δύο διαφορετικών πρωτεϊνών.
Η πρώτη ήταν η αλδολάση, μια πρωτεΐνη που βρίσκεται στους μυς και την οποία τα σύγχρονα συστήματα cryo-EM μπορούν ήδη να απεικονίσουν σχετικά εύκολα. Η δεύτερη ήταν η αιμοσφαιρίνη, η πρωτεΐνη που είναι υπεύθυνη για τη μεταφορά οξυγόνου μέσω της κυκλοφορίας του αίματος.
Χρησιμοποιώντας την πλάκα φάσης λέιζερ, οι ερευνητές βελτίωσαν την ανάλυση και των δύο πρωτεϊνικών δομών. Η βελτίωση ήταν ιδιαίτερα έντονη στην περίπτωση της αιμοσφαιρίνης, αναδεικνύοντας τις δυνατότητες της τεχνολογίας να ξεπεράσει τις δυσκολίες που σχετίζονται με τα μικρότερα μόρια.
«Το βασικό συμπέρασμα είναι ότι, εάν διαθέτετε μια μεγάλη πρωτεΐνη και ένα πραγματικά καλό δείγμα —ένα φρέσκο δείγμα ή ένα που έχει καταψυχθεί χωρίς φυσαλίδες, για παράδειγμα— ενδέχεται να μη χρειάζεστε την πλάκα φάσης για να λάβετε μία εικόνα υψηλής ποιότητας. Ωστόσο, για μια μικρή πρωτεΐνη και ένα δείγμα κακής ποιότητας, η ενεργοποίηση του λέιζερ είναι η καλύτερη επιλογή», δήλωσε ο Müller.
«Αυτό θα μπορούσε να καλύψει ένα τεράστιο κενό στις γνώσεις μας σχετικά με τις πρωτεϊνικές δομές που δεν μπορούν να κρυσταλλωθούν ή είναι υπερβολικά μικρές για τα σημερινά συστήματα cryo-EM. Και θα αποτελέσει επαναστατική εξέλιξη για την cryo-ET».
Η συμβατική cryo-EM δυσκολεύεται να απεικονίσει πρωτεΐνες μικρότερες από περίπου 70 kilodalton. Ο περιορισμός αυτός είναι ιδιαίτερα σημαντικός, καθώς οι πρωτεΐνες κάτω από αυτό το όριο αντιστοιχούν περίπου στο 90% του ανθρώπινου πρωτεώματος, δηλαδή του συνόλου των πρωτεϊνών που παράγονται από τον ανθρώπινο οργανισμό.
Με την πλάκα φάσης λέιζερ, οι ερευνητές μπορούν πλέον να απεικονίζουν πρωτεΐνες μεγέθους μόλις 50 kilodalton, αν και η διαδικασία εξακολουθεί να είναι δύσκολη. Αυτές οι πρωτεΐνες είναι ακόμη μικρότερες από την αιμοσφαιρίνη.
Ο επόμενος στόχος είναι η αποκάλυψη ακόμη μικρότερων πρωτεϊνών
Ο Müller πιστεύει ότι η τεχνολογία θα μπορούσε τελικά να επιτρέψει στους επιστήμονες να μελετούν πρωτεΐνες μεγέθους μόλις 17 kilodalton, όπως η μυοσφαιρίνη. Η επίτευξη αυτού του στόχου ενδέχεται να απαιτήσει μια ακόμη βελτίωση: τη χρήση μιας στενά εστιασμένης δέσμης ηλεκτρονίων αντί για τη δέσμη εκτός εστίασης που απαιτείται σήμερα για την παραγωγή επαρκούς αντίθεσης χωρίς την πλάκα φάσης λέιζερ.
Σύμφωνα με τον Müller, το σύστημα λέιζερ θα πρέπει να καταστήσει δυνατή την άμεση λήψη αντίθεσης από τις μεταβολές φάσης σε μια εστιασμένη δέσμη ηλεκτρονίων. Εάν η προσέγγιση αυτή αποδειχθεί επιτυχής, θα μπορούσε να διπλασιάσει εκ νέου την αντίθεση και τον λόγο σήματος προς θόρυβο, προσθέτοντας στη βελτίωση που έχει ήδη επιτευχθεί με την πλάκα φάσης λέιζερ.
Μια τέτοια πρόοδος θα μπορούσε να καταστήσει δυνατή τη μελέτη ενός πολύ μεγαλύτερου ποσοστού των πρωτεϊνών του ανθρώπινου οργανισμού και να προσφέρει πρωτοφανείς γνώσεις για τον τρόπο με τον οποίο αλληλεπιδρούν στο σύνθετο περιβάλλον των κυττάρων.
«Αυτή η τεχνολογία αποτελεί ένα τεράστιο άλμα για τη βιολογία», δήλωσε η Stephani Otte, αντιπρόεδρος της Biohub για την επιστήμη της απεικόνισης. «Θα μπορέσουμε να δούμε πώς λειτουργούν οι μοριακές μηχανές μέσα στο ζωντανό κύτταρο, στο φυσικό τους περιβάλλον, για πρώτη φορά. Αυτό που κάποτε ήταν αόρατο θα γίνει ορατό — και αυτό αλλάζει τα πάντα στον τρόπο με τον οποίο κατανοούμε τις ασθένειες».
Στην ερευνητική ομάδα του Μπέρκλεϊ συμμετέχουν επίσης ο Glaeser, οι μεταδιδακτορικοί ερευνητές και συν-πρώτοι συγγραφείς Petar Petrov και Jessie Zhang, ο επιστημονικός συνεργάτης Jonathan Remis, ο μεταδιδακτορικός ερευνητής Hang Cheng, καθώς και οι νυν και πρώην μεταπτυχιακοί φοιτητές Φυσικής Jeremy Axelrod, Eric Cooper, Ian Hicklin, Shahar Sandhaus και Cooper Schnurr.
Στο Biohub, η Carragher και ο David Agard, ιδρυτικός επιστημονικός διευθυντής απεικόνισης του οργανισμού, ηγούνται από κοινού της ομάδας Δυναμικής Δομικής Κυτταρικής Βιολογίας. Και οι δύο είναι συν-ανταποκρινόμενοι συγγραφείς της προδημοσίευσης του Biohub, μαζί με τον μηχανικό του οργανισμού Pavel Olshin.
www.worldenergynews.gr
